体细胞克隆猴：开启新药研发“灵长类”时代

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　“开始做这个项目时，我的预期是2020年能做出来就很不错了。” 中国科学院神经科学研究所（以下简称“中科院神经所”）所长蒲慕明告诉科技日报记者。

　　中科院神经所研究员孙强从蒲慕明那接到体细胞克隆猴任务时，给自己和团队的时间是十年。事实上，他们仅用了五年就做出让学术界瞩目的成果。

　　2017年11月27日，世界上首只体细胞克隆猴“中中”在中科院神经所、脑科学与智能技术卓越创新中心的非人灵长类研究平台诞生；同年12月5日，第二只克隆猴“华华”诞生。这一成果标志着中国率先开启了以体细胞克隆猴作为实验动物模型的新时代。

　　今年1月份，孙强团队与同属于中科院神经所的张洪钧团队合作，再获佳绩：在张洪钧团队利用CRISPR/Cas9技术成功构建世界首批核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型的基础上，孙强团队通过一只症状最明显的公猴的体细胞克隆出五只小猴。这项进展说明中国科学家已可以批量生产遗传背景均一的疾病猕猴模型。

　　梦寐以求多年但无法达成的目标

　　遗传背景单一的非人灵长类动物模型是科研人员梦寐以求多年但无法达成的目标。

　　“用小鼠做药效检测，可以剔除遗传背景因素，更好地观察药效。”蒲慕明说。但是，由于小鼠的基因、代谢和脑组织结构和生理等方面与人类差别太大，部分药物作用在人类和小鼠上的效果也差别巨大，相比之下，与人类基因更接近的灵长类动物显然是更好的动物模型。

　　非人灵长类动物首选对象肯定是猴子。可是野生猴的遗传背景各异、个体表征差异难统一，每次科学实验或药物检测的对照验证，需要使用大量实验猴，而且野生猴繁殖周期长、单胎数量少，验证工作常常持续很多年，时间过于漫长。所以想将其作为动物模型，最大的难题就是如何获得遗传背景相同的猴子。

　　“小鼠繁殖很快，自然繁殖几代后它们的遗传背景就相同了。猴子繁殖一代就要五六年，所以唯一的办法就是克隆。”蒲慕明说。

　　但克隆猴太难了。美国、中国、德国、日本、新加坡和韩国等世界科研机构都在攻关非人灵长类体细胞克隆，均未成功。此前，体细胞克隆猴最接近成功的一次是在2010年，美国俄勒冈灵长类研究中心在给代孕猴妈妈胚胎移植后的第81天发生流产。“只有获得遗传背景相同的克隆猴，才能最大程度发挥平台的作用，真正推进相关药物的研发。美国科学家还差一半就成功了。我们也很有希望成功，但要做好剩下的一半。”蒲慕明说。

　　超高实验技巧完成艰难的“另一半”

　　剩下的“另一半”却远比想象艰难许多。

　　孙强分析，在体细胞克隆猴技术具体操作上，主要有两大难点。第一点，“拿掉细胞核的时候不能抽掉周围太多营养物质，否则细胞就不发育了”。此外，移植到卵细胞中的，是成熟的、只表达某些特定基因的体细胞细胞核，研究人员需要想办法让它重新变成一个未分化的全能胚胎细胞。

　　孙强解释道，由于猴子细胞不透明，在显微镜下看不到细胞核，需要通过偏振光才能把细胞核显示出来。在孙强团队的研究记录视频中，研究人员注视着显微镜，在一闪一闪的偏振光下，操纵10微米左右直径的极细针头在细胞里吸取、注射，并尽可能减小对细胞的损伤，其难度远大于操纵绣花针。

　　除了去核要求速度快外，将体细胞核注入去核卵细胞同样要求非常快，“我们的团队成员可以做到15秒内实现体细胞注入操作，只有精湛的技术才可以保证对卵细胞损伤最小。”孙强说。

　　第二点，在核基因组启动前，体细胞核要经历一个回复到早期胚胎核状态的过程，也就是重编程。只有将这个过程控制好，才能提高体细胞胚胎的发育率。在尝试各种调控方法效果均不理想后，2014年，孙强团队在一篇报道中看到一种新的酶处理方法，并最终用这一方法将囊胚率提升到45%，优质胚胎率升高到29%。最终，孙强团队用127枚卵母细胞，做了109个重构胚胎，对21只猴子受体进行移植，获得6只怀孕受体，最后只有两只在2017年顺利出生。

　　“这个工作证实了猕猴可以用体细胞来克隆，并且，它可以成为有用的动物模型。”蒲慕明认为。

　　将构建足够数量的疾病模型猴

　　短短一年后，中科院神经所科研团队再次用体细胞克隆技术生成了5只遗传背景相同的模型猴——世界首批核心节律基因BMAL1敲除猕猴模型。记者在中科院神经所非人灵长类研究平台看到，一只半岁多的猴子，躲在孵育箱角落里。它就是神经所科研团队创建的世界首例生物节律紊乱猴克隆后代之一。

　　生物节律的基础研究与转化干预目前亟须好的生物模型。2016年9月，张洪钧团队首次利用基因修饰方法，得到一批生物节律核心基因BMAL1缺失的猕猴。

　　然而，通过基因敲除方法获得的第一代模型猴，容易产生嵌合体，这成了研究的最大阻碍。由于这一批猴的生物节律紊乱严重程度不一致，无法作为理想的动物模型。随着“中中”“华华”的诞生，研究人员开始思考，能否利用克隆猴技术，构建出疾病模型猴？

　　孙强团队马不停蹄，在国际上首次获得5只遗传背景一致的生物节律紊乱克隆猴。

　　“这个成果比首例体细胞克隆猴更进一步的地方在于，上次用的是流产胚胎的体细胞，这次用的是活猴的体细胞来克隆的，可以在两代猴之间进行比对。”蒲慕明说，更重要的是，此次克隆的是一种有疾病表型的猴，这首次证实通过体细胞核移植技术可以克隆成年基因修饰猴，进一步表明克隆猴作为疾病模型的有效性。

　　“这些脑疾病模型克隆猴，未来将有助于解析脑重大疾病的致病机理、确立预警和早期诊断指标、进行干预和治疗等。建立基于疾病模型猴的非人灵长类平台，将成为中国脑计划的一大亮点。”蒲慕明表示。